HCN-Kanäle werden durch hyperpolarisierende Spannungen aktiviert und durch die Bindung zyklischer Nukleotide moduliert (HCN = hyperpolarization activated and cyclic nucleotide gated). Als sogenannte Schrittmacherkanäle sind sie an der rhythmischen Erregung spezieller Herzzellen und Neurone beteiligt. Außerdem spielen sie eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung neuronaler Ruhemembranpotentiale, bei der Ausbildung erregender postsynaptischer Potentiale sowie bei der Entstehung von Schmerzempfindungen.

HCN-Kanäle gehören zur Superfamilie der spannungsgesteuerten Ionenkanäle und weisen den typischen Aufbau spannungsgesteuerter Kaliumkanäle auf. Es handelt sich damit um tetramere Kanalproteine, in denen sich die vier Untereinheiten symmetrisch um eine zentrale Pore gruppieren. Jede Untereinheit besteht aus sechs transmembranären Helices. Die Bindungsstelle für zyklische Nukleotide befindet sich jeweils am intrazellulären C-terminalen Ende. Die HCN-Kanäle sind strukturell den ebenfalls in unserem Labor untersuchten CNG-Kanälen (CNG = cyclic nucloetide gated) ähnlich.

Patchpipette mit einem aus der Zelle herausgerissenen Membranpatch. Die Membran enthält eine hohe Anzahl an fcAMP-bindenden HCN2-Kanälen.

Um die Ligandenbindung und Kanalaktivierung simultan untersuchen zu können, etablierten wir in unserem Labor die konfokale Patch-Clamp-Fluorometrie (konfokale PCF). Dabei wid die elektrophysiologische Patch-Clamp-Technik mit der konfokalen Lasermikroskopie kombiniert (Biskup et al., 2007; Kusch et al., 2010). Für die Untersuchung der HCN-Kanäle, bei denen die Applikation des Liganden von der intrazellulären Membranseite erforderlich ist, verwenden wir die Inside-out-Konfiguration. Den für die konfokale PCF notwendigen fluoreszierenden Liganden (DY547-AET-cAMP = fcAMP) entwickelten wir in Zusammenarbeit mit den Firmen Dyomics (Jena) und Biolog FSI (Bremen). Die Abbildung zeigt das konfokale Bild einer Patch-Pipette mit einer HCN2-exprimierenden Membran unter Applikation von 1 µM fcAMP.

Mit Hilfe dieser Technik können wir die Kanalaktivierung in direkter Abhängigkeit von der Ligandenbindung und umgekehrt auch die Ligandenbindung in direkter Abhängigkeit von der Kanalaktivierung beobachten. Somit konnte zum Beispiel die reziproke Beziehung zwischen diesen beiden Parametern für den homotetrameren HCN2-Kanal experimentell belegt werden. Durch die globale mathematische Analyse der optischen und elektrophysiologischen Daten waren wir in der Lage, ein kinetisches Modell (Markov-Modell) für die Beschreibung der ligandenabhängigen Aktivierung des HCN2-Kanals aufzustellen (Kusch et al., 2012).