Zielsetzung

Aufklärung der Stuktur, Funktion und Regulation epithelialer Zell-Zellkontakte

Hintergrund

Die auf der Oberfläche von Zellen vorliegenden Zelladhäsionsmoleküle erlauben es den Zellen eines Organismus, spezifische Wechselwirkungen mit anderen Zellen oder der sie umgebenden extrazellulären Matrix einzugehen. Polarisierte epitheliale Zellen stehen über charakteristische Zell-Zellkontaktstrukturen (Tight Junction, Adherens Junction, Desmosomen, Gap Junctions) miteinander in Verbindung, die für die jeweilige Funktion von essentieller Bedeutung sind. Dabei vermitteln sie vielfältige Prozesse während der Entwicklung eines Organismus und sind somit wichtig für die Entstehung von Geweben und Organen. Auch im adulten Organismus sind diese Kontakte für eine Vielzahl von Prozessen von zentraler Bedeutung, z.B. bei der Aufrechterhaltung der Gewebestruktur, Zell­wanderungsprozessen im Rahmen der Wundheilung und Immunantwort und bei der Regulation des Zelltods. Der Verlust der Zelladhäsion geht im Rahmen der Tumorprogression häufig mit gesteigerter Invasivität und Metastasierung einher. Unsere Arbeiten sollen zum Verständnis der molekularen Mechanismen beitragen, über die Zell- Zellkontakte an diesen Prozessen beteiligt sind.

Abb. 1: Schematische Darstellung typischer epithelialer Zell-Zellkontakte und ihres molekularen Aufbaus. Gap Junctions wurden aus Übersichtsgründen nicht berücksichtigt.

Cadherin-vermittelte Zell-Zellkontakte

Cadherine repräsentieren eine große Familie an Calcium-abhängigen Zelloberflächen­glyko­­proteinen, die eine essentielle Rolle bei der Morphogenese und Differenzierung spielen. Sie stellen sowohl in den Adherens Junctions (AJ), als auch in den Desmosomen die zentralen Adhäsionsmoleküle dar und sind über charakteristische Adapterproteine mit dem Cytoskelett (Aktin: AJ bzw. Intermediärfilamente: Desmosomen) verbunden. Ein Verlust oder eine Verringerung der Cadherin-vermittelten Zell-Zelladhäsion wurde in verschiedenen klinischen Zusammenhängen beobachtet. So wird bei der Tumorgenese im Rahmen der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), die mit erhöhter Invasivität und Metastasierung einhergeht, die Transkription von E-Cadherin reprimiert. Bei Hauterkrankungen (z.B. Pemphigus vulgaris, Pemphigus foliaceus) beeinträchtigen Autoantikörper gegen Desmogleine die Adhäsion zwischen Keratino­zyten und führen so zur typischen Blasenbildung. Neben den vielfältigen Morphogeneseprozessen erfordern Wundheilungsprozesse eine genaue Regulation von Cadherin-vermittelten Zell-Zellkontakten.

Struktur, Funktion und Regulation von Tight Junctions

Tight Junctions (TJs) sind die in polarisierten epithelialen und endothelialen Geweben am weitesten apikal gelegenen Zell-Zellkontaktstrukturen. Sie bilden eine Barriere, die die unkontrollierte Passage von Ionen, Soluten, Wasser, Toxinen oder Mikroorganismen durch den parazellulären Spalt verhindert. Neben dieser Barrierefunktion unterbinden die TJs die freie Diffusion von Transmembranproteinen von der apikalen zur basolateralen Seite der Zellen und tragen somit entscheidend zur Aufrechterhaltung der Polarität bei (Abb. 2). TJs bestehen aus hochmolekularen Proteinkomplexen, die ein perlschnurartiges Netzwerk aus TJ-Strängen ausbilden, über das die Membranen benachbarter Zellen in sehr engen Kontakt zueinander gebracht werden. Dieses Netzwerk ist aus den integralen Membranproteinen der TAMP (tight junction-associated MARVEL proteins)-Familie, zu denen Occludin, Tricellulin und MarvelD3 gezählt werden, sowie aus Mitgliedern der Claudin-Familie (Cldn1-27) aufgebaut. An die cytoplasmatischen Domänen dieser 4-Transmembran­domä­nen­proteine binden verschiedene Adapter- und Regulator­protei­ne wie die Zonula occludens Proteine (ZO-1, -2, -3), die die TJs mit dem Aktin­cytoskelett verknüpfen. Daneben sind Transmembanproteine der Ig-Super­familie (JAM, CAR, ESAM) an den TJs nachgewiesen worden.

Abb. 2: Aufbau und Struktur der Tight Junction. Schematische Darstellung des Aufbaus von TJs. Gefrierbruchelektronen­mikros­kopische Darstellung des TJ Strang-Netzwerks (Dr. Martin Westermann, EM-Zentrum, FSU Jena).

Strategie und Ergebnisse

Posttranslationale Modifikationen von TJ-Proteinen spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation der TJ-Struktur und Funktion. Zudem zeigte sich in den letzten Jahren, dass einige der mit Adhäsionskomplexen assoziierte Proteine eine sogenannte NACos (Nuclear and  adhesion complexes)-Funktion besitzen. Sie besitzen somit neben der Funktion in den Adhäsionskomplexen eine zweite Funktion im Zellkern, wo sie als Co-Faktoren an Prozessen der Transkriptionsregulation beteiligt sind. Damit besteht die Möglichkeit, dass Zell-Zellkontakten ausgehende Signale sehr schnell in den Zellkern weitergeleitet werden und zu Änderungen des Genexpressionsprogrammes führen können. Durch Identifizierung von an diesen Prozessen beteiligten posttranslationalen Modifikationen, Mutagenese der modifizierten Aminosäuren und Untersuchung der funktionellen Konsequenzen wollen wir ein besseres Verständnis über die Regulation von Zell-Zellkontakten bei der Tumorgenese, in der Sepsis und beim Altern erreichen.

Ausgewählte Referenzen

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Wetzel F, Mittag S, Cano-Cortina M, Wagner T, Krämer OH, Niedenthal R, Gonzales-Mariscal L, Huber O. SUMOylation regulates the intracellular fate of ZO-2. Cell Mol Life Sci (2017)  74:373-392.

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Westphal JK, Dörfel MJ, Krug SM, Cording JD, Piontek J, Blasig IE, Tauber R, Fromm M, Huber O. Tricellulin forms homomeric and heteromeric tight junctional complexes. Cell Mol Life Sci. (2010) 67<. 2057-2068

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Zielsetzung

Mechanismen der Regulation des kanonischen Wnt-Signalwegs

Hintergrund

Wnt-Signaling spielt eine zentrale Rolle bei vielen Prozessen während der Embryonalentwicklung. Genetische Untersuchungen haben gezeigt, dass Mutationen in Komponenten des Wnt-Signalwegs zu einer Vielzahl von teilweise schweren Entwicklungsdefekten führen. Wnt-Signale beeinflussen dabei verschiedene Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose. Aber auch im adulten Organismus spielt der Wnt-Signalweg eine essentielle Rolle, z.B. bei der Tumorgenese und bei Regenerationsprozessen. Bisher wurden 19 verschiedene Wnt-Liganden und 10 Frizzled (Fzd)-Rezeptoren in Säugern identifiziert. Die verschiedenen Wnt-Liganden werden entsprechend der von ihnen induzierten Signaltransduktionswege in kanonische und nicht-kanonische Wnts eingeteilt. Die Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs durch Bindung von Wnt-Liganden an Fzd-LRP5/6-Rezeptorkomplexe im Zusammenspiel mit weiteren Membranfaktoren (Lgr5, R-Spondin, ZNRF3, RNF43) führt letztendlich zu einer Stabilisierung von β-Catenin aufgrund der Inaktivierung des β-Catenin-Destruktionskomplexes und der damit einhergehenden Akkumulation von β-Catenin in Cytosol und Zellkern. Dort wirkt β-Catenin als Co-Faktor verschiedener Transkriptionsfaktoren, insbesondere von LEF/TCF und führt im Zusammenspiel mit einer Vielzahl weitere Komponenten (z.B. HATs, Chromatinremodelling-Faktoren, HDACs etc.) zur Expression von Zielgenen, die entsprechende Differenzierungs- und Entwicklungsprogramme induzieren. Eine Hyperaktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs, hervorgerufen durch Mutation von Komponenten des Signalwegs, ist oftmals ursächlich für die Entstehung von Tumorerkrankungen. So weisen z.B. spontane kolorektale Tumoren mit sehr hoher Häufigkeit Mutationen im Tumorsuppressorprotein APC auf, das als Komponente des Destruktionskomplexes eine zentrale Rolle bei der Regulation der Menge an freiem, signalkompetentem β-Catenin spielt. Als Folge wird β-Catenin nicht mehr phosphoryliert und ubiquitiniert, so dass es nicht mehr über den Ubiquitin-Proteasomen-Weg abgebaut werden kann. Da der kanonische Wnt-Signalweg auch eine zentrale Rolle bei der Selbsterneuerung von Stammzellen spielt, ist davon auszugehen, dass eine hyperaktiver Signalweg zur vermehrten Proliferation von sogenannten „Cancer stem cells“ führt und damit wesentlich zur Tumorentstehung beiträgt. Dabei steht der Wnt-Signalweg in einem komplexen Cross-talk mit weiteren Signalwegen wie z.B. dem Hippo-YAP/TAZ-Weg. Mittlerweile gibt es viele Hinweise, dass der Wnt-Signalweg auch unabhängig von Wnt-Liganden aktiviert werden kann. Zudem können Wnts neben Fzd-Rezeptoren auch an andere Rezeptoren binden und entsprechende Signalkaskaden aktivieren.

Strategie und Ergebnisse

Im Rahmen unserer Forschungsarbeiten interessieren wir uns insbesondere für den kanonischen Wnt-Signalweg. Ein besseres Verständnis der Regulation dieses Signalwegs bildet daher eine wichtige Grundlage für ein besseres Verständnis von Tumorgenese, Reparatur- und Regenerationsvorgängen, aber auch alternsassoziierten Veränderungen und metabolischen Prozessen. Daraus können neue Zielstrukturen für pharmakologische Ansatzpunkte oder Diagnosemarker abgeleitet werden. Unsere Arbeiten der letzten Jahre haben sich hauptsächlich mit der Identifizierung und Charakterisierung neuer Modulatoren der β-Catenin-Signalfunktion beschäftigt. Dazu zählen Pontin (Ruvbl1, Tip49a, Rvbl1) und Reptin (Ruvbl2, Tip49b, Rvbl2), die Histidin-Triaden (HIT)-Proteine  Hint-1/-2/-3 und Fhit, sowie Nit1 und Nit2.

Ausgewählte Referenzen

Mittag S, Valenta T, Weiske J, Bloch L, Klingel S, Gradl D, Wetzel F, ChenY, Petersen I, Basler K, Huber O. A novel role for the tumour suppressor Nitrilase1 modulating the Wnt/β-catenin signaling pathway. Cell Dicov (2016) 2:15039.

Abring KF, Weidemüller J, Mittag S, Weiske J, Friedrich K, Geroni MC, Lombardi P, Huber O. Berberine acts as a natural inhibitor of Wnt/β-catenin signaling – identification of more active 13-arylalkyl derivatives. Biofactors (2013) 39:652-662.

Yang L, Chen Y, Cui T, Knösel T, Albring K, Huber O, Petersen I. Desmoplakin has a tumor suppressive function through inhibition of Wnt/β-catenin signaling pathway in human lung cancer. Carcinogenesis (2012) 33:1619-1624.

Kim JH, Kim B, Cai L, Choi HJ, Ohgi KA, Tran C, Chen C, Chung CH, Huber O, Rose DW, Sawyers CL, Rosenfeld MG, Baek SH. Transcriptional regulation of a metastasis sppresssor gene by Tip60 and β-catenin complexes. Nature (2005) 434:921-926.

Hämmerlein A, Weiske J, Huber O. A second protein kinase CK1-mediated step negatively regulates Wnt signaling by disrupting the lymphocyte enhancer factor-1/ β-catenin complex. Cell Mol Life Sci (2005) 62:606-618.

Strategie und Ergebnisse

Im Rahmen unseres Projektes wird nach postranslationalen Modifikationen gesucht, die beim Alterungsprozess eine Rolle spielen könnten oder sich während des Alterns verändern. Nach Induktion von typischen altersassoziierten Stressbedingungen in Zellen (z.B. Glykierung, ROS, DNA-Schädigung) durch reaktive Metabolite oder Inhibitoren/Aktivatoren von Stress-Pathways werden Modifikationen an zelluläre Komponenten u.a. durch massenspektrometrische Analysen identifiziert. In weiteren Untersuchungen soll dann überprüft werden, welche Enzyme für die Modifikationen verantwortlich sind und ob sich Unterschiede hinsichtlich dieser Modifikationen, in den modifizierenden Enzymen oder den die Modifikationen entfernenden Enzymen in jungen und alten Mäusen nachweisen lassen. Zudem soll untersucht werden, welche zellulären Effekte durch die entsprechenden Modifikationen hervorgerufen werden. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen stehen dabei Faktoren des Wnt-Signalwegs und seiner Modulatoren, sowie Komponenten von epithelialen Zell-Zell-Kontakten.

Ausgewählte Referenzen

Ye Z, Mittag S, Schmidt M, Simm A, Horstkorte R, Huber O. Wnt glycation inhibits canonical signaling. Cells (2019) Oct 25;8(11). pii: E1320. doi: 10.3390/cells8111320

Kaiser A, Schmidt M, Huber O, Frietsch JJ, Scholl S, Heidel FH, Hochhaus A, Müller JP, Ernst T. SIRT7: an influence factor in healthy aging and the development of age-dependent myeloid stem-cell disorders. Leukemia (2020) in press doi:10.1038/s41375-020-0803-3

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Wetzel F, Mittag S, Cano-Cortina M, Wagner T, Krämer OH, Niedenthal R, Gonzalez-Mariscal L, Huber O. SUMOylation regulates the intracellular fate of ZO-2. Cell Mol Life Sci (2017) 74, 373-392. doi 10.1007/s00018-016-2352-5

Bork K, Weidemann W, Berneck B, Kuchta M, Bennmann D, Thate A, Huber O, Horstkorte R.The expression of sialyltransferases is regulated by the bioavailability and biosynthesis of sialic acids. Gene Expr Patterns (2017) 23-24, 52-58; doi: 10.1016/j.gep.2017.03.003